Для чего нужна ПЦР-диагностика

Методы, основанные на анализе ДНК, нашли широкое применение в диагностике многих заболеваний, в том числе генетических, раковых, паразитарных и инфекционных. Не говоря уже о том, что с помощью этих методов можно исследовать родство, выявить виновника преступления или определить совместимость тканей, благодаря чему удается избежать многих отторжений трансплантатов. Наиболее распространенным методом молекулярной диагностики в настоящее время является метод ПЦР. Фактически, ПЦР, или полимеразная цепная реакция, - это метод, используемый для дублирования интересующих нас фрагментов ДНК. 

Области применения ПЦР

С помощью техники ПЦР мы можем за короткое время получить миллиарды копий определенной последовательности ДНК. Затем мы можем определить ее длину и точное строение. Кроме того, этот метод часто используется для того, чтобы проверить, присутствует ли данная последовательность вообще в исследуемом нами образце. Примером может служить диагностика болезни Лайма, в ходе которой мы проверяем, попала ли ДНК бактерии Borrelia burgdorferi в наш организм после укуса клеща. В этом случае можно выявить возбудителя по появлению первых симптомов заболевания. При онкологических заболеваниях диагностируются так называемые генетические маркеры, то есть любые изменения, мутации, которые появляются в данном гене. Обычно такая диагностика не включает анализ одной последовательности, анализируются целые гены. Среди прочего, метод ПЦР позволяет диагностировать поражения, выявление которых позволяет определить предрасположенность к определенным типам опухолей.

ПЦР: что из себя представляет методика?

Сначала нужно изолировать ДНК от наших клеток. После того, как получена изолированная и очищенная ДНК, можно проводить реакцию дублирования интересующего нас фрагмента. Для этого мы должны обладать специально синтезированными короткими фрагментами ДНК - так называемыми праймерами. Обычно, принято использовать два праймера, которые должны будут связаться с каждым концом шаблонной ДНК. Затем готовят реакционную смесь, которая включает следующие компоненты:

• матрица - фрагмент ДНК, который мы хотим дублировать;
• праймеры, упомянутые выше;
• дезоксинуклеотидные трифосфаты (dNTP), то есть необходимые субстраты, используемые для синтеза дублируемой ДНК;
• термостабильная ДНК-полимераза  -фермент, катализирующий реакцию;
• соответствующий буферный раствор, который обеспечивает адекватный рН реакции.

Все это помещается в так называемый термоциклер, - устройство, способное быстро и циклически изменять температуру. Образец сначала нагревается до температуры 90-95ºC, что позволяет развернуть (денатурировать) спираль ДНК матрицы. Затем образец охлаждают до температуры, при которой могут присоединяться праймеры. Для разных праймеров этот показатель может отличаться отличается, обычно он составляет 45-70ºC. На третьем этапе температура поднимается до значения, которое является оптимальным для работы ДНК-полимеразы (около 72ºC). Праймеры удлиняются, и участок между ними реплицируется полимеразой. В итоге образуется нить ДНК, комплементарная к матрице. Вышеупомянутый цикл повторяется до тех пор, пока не будет получено нужное количество продукта (ДНК). Затем проверяют, присутствовал ли интересующий нас фрагмент в образце и какую длину он имеет. Обычно это делается путем электрофореза фрагментов ДНК в агарозном геле.

Метод ПЦР применяется в нескольких различных вариациях. Наиболее часто используемой в настоящее время разновидностью ПЦР является так называемая ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР). Этот метод основан на классической технике ПЦР и имеет два основных преимущества: высокая чувствительность реакции, а также возможность контролировать количество продуктов реакции после каждого цикла. Процедура проста, быстра и экономит время на утомительном анализе количества продукта после завершения реакции. Кроме того, с помощью ОТ-ПЦР можно одновременно анализировать несколько генов из нескольких различных образцов. Для визуализации наличия ДНК используются всевозможные флуоресцентные зонды, которые содержат в своей структуре флуоресцентный краситель, способный излучать свет определенной длины волны. Используя различные флуоресцентные красители, можно одновременно анализировать несколько последовательностей ДНК в одном образце. 

В нашем интернет-магазине вы можете приобрести широкий ассортимент пробирок для ПЦР-диагностики по низким ценам. Обращайтесь!